La muerte de Alfonso XII dio paso a una breve etapa de incertidumbre, que se disiparía con la llegada de su hijo póstumo, Alfonso XIII, rey desde su nacimiento (caso inédito en la Historia de España). Durante su minoría de edad, se llevó a cabo la regencia de María Cristina de Austria, la reina viuda.
La época de la Regencia estuvo marcada, a nivel nacional, por la prosperidad y, sobre todo, por el Desastre del 98. Y en Dos-Hermanas, aquella etapa fue también de tranquilidad y bonanza, pero, a la vez, estuvo marcada por diversos escándalos políticos y, sobre todo, por la influencia del carlismo, que llegaría al poder, finalmente, en 1899.
1. Pedro Olmedo Díaz
Partido Liberal. Alcalde Constitucional interino: 18-XII-1885 / 23-XII-1885. Tras la destitución de García Bando, Pedro Olmedo (cuya familia tenía en arrendamiento la huerta situada junto a la hacienda de San Antonio) se hizo cargo provisionalmente de la alcaldía.
2. Francisco Valera Aguilar
Partido Liberal. Alcalde Constitucional: 23-XII-1885 / 31-XII-1890. De oficio veterinario, contaba con el respeto y cariño de sus convecinos. Durante su mandato se dio la primera huelga de la que se tiene constancia en Dos-Hermanas (1886), llegó a Dos-Hermanas una comunidad religiosa que aún permanece (las Dominicas del Santísimo Sacramento) y se crearon las escuelas n.º 2 de niños y de niñas. También bajo su mandato se procedió al arreglo de numerosas calles del pueblo y se instalaron en Dos-Hermanas el teléfono (en la Alquería del Pilar) y la luz eléctrica (en la fábrica de yute).
3. José García Casado
Partido Liberal. Alcalde Constitucional interino: 01-I-1891 / 31-I-1891. Accede a la alcaldía de manera interina ante la marcha de Valera Aguilar.
4. Manuel García Bando
Partido Conservador. Alcalde Constitucional: 01-II-1891 / 30-VI-1891. De nuevo volvió a la alcaldía de la villa, siendo su segundo mandato breve y sin apenas hechos destacados.
5. Antonio Valera Martín
Partido Conservador. Alcalde Constitucional: 01-VII-1891 / 30-VI-1895. Primo segundo de Francisco Valera Aguilar, y también de oficio veterinario, su mandato estuvo marcado por los escándalos políticos. A ellos se unió la grave crisis agrícola que se inició en 1892 y la epidemia de fiebre palúdica de 1894. También bajo su mandato, se celebró la primera romería de Valme en octubre de 1894. Dejó numerosas deudas en el consistorio, que no serían saldadas hasta principios del siglo XX. Fue cesado por el gobernador civil.
6. Juan Rubio Cózar
Partido Conservador. Alcalde Constitucional: 1-VII-1895 / 20-IV-1897. El sucesor de Valera Martín tampoco estuvo exento de polémica, debido, en gran parte, a su pésima administración.
7. Francisco Ávila Ramos
Partido Conservador. Alcalde Constitucional: 20-IV-1897 / 30-VI-1897. Gran amigo de Lamarque de Novoa, en su etapa de alcalde, la calle Real de Sevilla pasó a denominarse Nuestra Señora de Valme. Abandonó el cargo para ejercer el de juez municipal.
8. Francisco Baena de León Izquierdo
Partido Conservador. Alcalde Constitucional: 01-VII-1897 / 01-II-1899. Le podríamos llamar el Alcalde de la Paz, pues fue él quien consiguió traer (aunque fuera de manera momentánea) la ansiada estabilidad política perdida durante los mandatos de Valera Martín y Rubio Cózar. Durante el suyo se creó la Biblioteca Popular de Dos-Hermanas (1897), se repararon diversas calles y se celebraron funerales por la muerte de Cánovas del Castillo.
9. José Lázaro Alcuña
Partido Conservador. Alcalde Constitucional interino: 1-II-1899 / 30-IX-1899. Tras la dimisión de Baena de León, ocupó la alcaldía de manera provisional José Lázaro Alcuña, nieto de José Lázaro García, alcalde de la villa en tiempos de Isabel II.
10. Manuel Rodríguez y Rodríguez
Partido Carlista. Alcalde Constitucional: 1-X-1899 / 02-X-1901. Las elecciones municipales de 1899 dieron como resultado el triunfo de los carlistas y del sector católico del Partido Conservador. Ambos se aliaron, colocándose al frente de la alcaldía a Manuel Rodríguez, perteneciente al sector carlista y muy amigo de don Jesús de Grimarest. Bajo su mandato se adecentó la plaza de Alfonso XII (1900), se cambió parte del nomenclátor y se mejoró la explanada de la estación. Presentó su dimisión en 1901.
11. Fernando Muñoz García
Partido Conservador-católico. Alcalde Constitucional: 02-X-1901 / 08-IX-1904. Él será el último alcalde de la Regencia y, al mismo tiempo, el primero del reinado efectivo de Alfonso XIII. Durante su mandato se inauguró la primera casa de socorro (1902).